オートファジーフォーラム

• 哺乳類細胞で使える簡便で定量性の高いパルスチェイス型オートファジー活性レポーターの開発　– HaloTag processing assay –
• Posted by 日本医科大学・先端医学研究所　山本 林
• 投稿日 2022/08/15

最近、eLifeに掲載された私たちの論文を紹介させて頂きます。

オートファジーの研究を進めるにはオートファジー活性を評価・定量する方法が不可欠ですが、哺乳類細胞ではGFP-LC3-RFPやRFP-GFP-LC3といったレポーターが開発されているものの、いずれもFACSや蛍光顕微鏡観察を必要とするなど、簡便で定量性の高い方法がないというのが現状でした。一方、出芽酵母では1992年のオートファジーの発見からわずか３年後の1995年には大隅研でALP assayが開発され、簡便で定量性の高い方法が早期に確立されたことが出芽酵母オートファジー研究の飛躍的な進展に繋がりました。その後、より簡便なGFP-Atg8 processing assayが開発され、これは、GFP-Atg8が液胞内で分解されて生じるGFP断片の量をオートファジー活性としてウェスタンブロッティングで定量する方法となります。現在ではGFPを任意のターゲットタンパク質に付加することで、選択的オートファジーやオルガネラ分解の定量レポーターとして広く使われています。

このGFP processing assayを哺乳類細胞に応用する試みはこれまでにも行われていますが、GFPはリソソーム内で分解されやすく、GFPの代わりに分解耐性の高いRFPを用いた場合には、オートファジー誘導の前からリソソーム内へのRFP断片の蓄積が見られ、これは哺乳類細胞では恒常的オートファジーの活性が高いためだと考えられます。これらの問題を解決するため、パルスラベル型のタンパク質タグであるHaloTag (Promega) を用いたところ、HaloTagはリガンドと共有結合することではじめてリソソーム分解耐性となることが分かり、HaloTag-LC3をレポーターとすることでオートファジー活性を任意のタイミング（リガンド添加）から経時的に定量できるようになりました。TMRなどの蛍光性HaloTagリガンドを用いることで、HaloTagTMR-LC3およびHaloTagTMR断片をin-gelのまま蛍光検出することができるためウェスタンブロッティングの必要もなく、HaloTagTMR断片が検出される飢餓1-2時間の短時間からオートファジー活性の定量が可能で、飢餓数時間まで高い直線性と定量性を示します。また、HaloTag-GFPなどのLC3非依存型のレポーターをサイトゾルに発現させることで、非選択的オートファジー活性を定量することも可能となりました。HaloTag-GFPをERやミトコンドリアに局在させることで、ERphagyやMitophagyを簡便に短時間で定量することも可能です。また、HaloTag-GFP-LC3にすることでRFP-GFP-LC3型レポーターのようにオートファゴソームからオートリソソームへの変化を蛍光顕微鏡下で観察するが可能となり、さらにRFPを追加してHaloTag-GFP-LC3-RFPにすることでFACSでの定量も可能なthree-in-oneレポーターとして利用することもできます。

HaloTag processing assayのウィークポイントとしては、細胞をすりつぶす必要があるため生細胞でのスクリーニングに使えないという点とリガンドが高額という点が挙げられます。前者は、もともとGFP-LC3-RFPでのCRISPRスクリーニングが頭にあったので、これと相補的な使用方法になるだろうと考えていました。上記のthree-in-oneレポーターはGFP-LC3-RFPとHaloTag processing assayの両方を備えたレポーターとして作ってみました。後者は、、、未解決です、節約して使ってみてください、それでも定量性高く検出できると思います。

HaloTag processing assayは簡便で定量性が高く、汎用性も高いことから、今後、多くのみなさんに使って頂ければと思っています。論文に使用したレポーターは全てAddgene（https://www.addgene.org/browse/article/28225176/）に入れてありますので。

なお、本研究は東京大学大学院医学系研究科水島研究室で行われたものになります。
私自身はこの７月から日本医科大学先端医学研究所に移って小さなラボをスタートしたところです。スタッフやポスドクを募集していますので興味のある方は是非ご連絡ください。よろしくお願いします。

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